在這項(xiàng)研究中，我們假設(shè)傳感器系統(tǒng)可用于小膠質(zhì)細(xì)胞代謝的無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以進(jìn)一步闡明動(dòng)態(tài)微環(huán)境下特定表型的極化水平。我們?cè)O(shè)計(jì)并制造了一種微流控芯片，用于在連續(xù)流動(dòng)下培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，并將氧氣和 pH 值的變化與激活后的極化狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。

炎癥是由外來(lái)抗原、病原體和化學(xué)物質(zhì)等刺激引發(fā)的一系列復(fù)雜事件。它在多種疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如自身免疫性疾病、癌癥和傷口愈合過(guò)程 [1]。巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞由于其抗原呈遞、吞噬作用和免疫調(diào)節(jié)特性而分別在炎癥和神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用 [2]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞的一種亞型，在神經(jīng)免疫反應(yīng)中也像巨噬細(xì)胞一樣發(fā)揮作用 [3]。根據(jù)它們?cè)谏砦h(huán)境中暴露的信號(hào)，小膠質(zhì)細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為兩種不同的表型，稱(chēng)為 M1 和 M2 [4]。也稱(chēng)為“經(jīng)典激活”的促炎 M1 小膠質(zhì)細(xì)胞可以由脂多糖 (LPS) 誘導(dǎo)，而 IL-4 和 IL-13 誘導(dǎo)“交替激活”抗炎 M2 表型 [5,6]。為了響應(yīng)對(duì) M1 表型的刺激，已顯示巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)生代謝變化。在 LPS 刺激期間，產(chǎn)生的一氧化氮 (NO) 會(huì)抑制氧化磷酸化，從而導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)為糖酵解。由于這種反應(yīng)，乳酸產(chǎn)量增加，這反過(guò)來(lái)又增加了細(xì)胞外酸化率 (ECAR)。監(jiān)測(cè) pH 值的變化可以深入了解細(xì)胞和組織的生理和代謝狀態(tài) [7]。小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)通常可以通過(guò)基因表達(dá)、細(xì)胞表面標(biāo)志物和釋放到培養(yǎng)基中或在細(xì)胞外基質(zhì)中積累的蛋白質(zhì)來(lái)檢測(cè)。在這方面PCR、流式細(xì)胞儀、ELISA 和 Western Blotting 是尤為常見(jiàn)的方法之一，它們具有侵入性、費(fèi)力且耗時(shí)。這些技術(shù)也不能提供關(guān)于極化狀態(tài)變化的洞察力和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。體外 實(shí)驗(yàn)。微流控芯片上的器官系統(tǒng)通過(guò)為異質(zhì)細(xì)胞群提供具有動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模型的 3D 分層架構(gòu)，提供了出色的體外 平臺(tái)來(lái)模擬復(fù)雜的器官/組織。先前已經(jīng)報(bào)道了具有復(fù)雜病因的疾病的神經(jīng)炎癥模型，這進(jìn)一步突出了生物工程微環(huán)境的優(yōu)勢(shì)[8]。

材料與方法

微流控芯片由聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 制成，因?yàn)樗哂腥犴g性，便于插入傳感器插頭和密封泄漏。為了制造芯片的 PDMS 組件，PDMS 分別用 1:10 的固化劑和 PDMS 混合物澆鑄在聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 模具上。在真空下脫氣后，將模具在 80 ºC 下烘烤一小時(shí)，然后從模具中切出碎片。芯片 A 是一種混合芯片，包括 PMMA 和 PDMS 組件。芯片的底部包含一個(gè)用于 3D 培養(yǎng)和流體流動(dòng)的通道，在這些層上帶有一個(gè) PDMS 層，帶有入口、出口和傳感器插頭端口。有一個(gè)額外的 PMMA 層包圍了芯片，為光纜提供結(jié)構(gòu)支撐，從而促進(jìn)螺栓的壓縮。所有這些層都在 6 個(gè)螺栓的幫助下結(jié)合在一起（圖 1C）。芯片 B 有兩層。在軟光刻之后，將制造的 PDMS 組件等離子結(jié)合到顯微鏡載玻片上。鍵合后，將這些芯片放置在 120°C 的熱板上 2 小時(shí)以增強(qiáng)鍵合強(qiáng)度。

圖 1：用于 3D 和 2D 小膠質(zhì)細(xì)胞極化的兩種不同制造的微流控芯片的圖像。用于 3D 細(xì)胞培養(yǎng)的芯片 A 的設(shè)計(jì)：A) AutoCAD 圖紙，尺寸以 [mm] 為單位，B) 芯片 A 從上到下的層數(shù)，C) 帶有藍(lán)色染料和傳感器插頭假人的芯片 A 的圖像，芯片 B 的設(shè)計(jì)用于2D 細(xì)胞培養(yǎng)：D) 芯片 B 的尺寸，E) 芯片 B 的層數(shù)，F(xiàn)) 帶有紅色染料和傳感器插頭假人的芯片 B 的圖像。 N9小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系用于巨噬細(xì)胞極化實(shí)驗(yàn)。使用* RPMI（無(wú)酚）培養(yǎng)基 1640（補(bǔ)充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素/鏈霉素 (Pen/Strep)）進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。將細(xì)胞培養(yǎng)至 80% 融合并用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 收獲。用高細(xì)胞密度 (4.5 x 10 5細(xì)胞/cm 2 )接種乙醇滅菌的芯片，并在靜態(tài)條件下在 37 °C 和 5% CO 2下孵育過(guò)夜。

一旦小膠質(zhì)細(xì)胞粘附并形成單層培養(yǎng)物，就使用注射泵（哈佛儀器）以 0.5 µl/min 的連續(xù)流量進(jìn)行管理（圖 2）。用 300 ng/ml 脂多糖 (LPS) 將小膠質(zhì)細(xì)胞極化為 M1 樣表型 24 小時(shí)。在整個(gè)研究過(guò)程中，未刺激的細(xì)胞用作對(duì)照組。將微流控芯片放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，并將傳感器插頭連接到光纖電纜。收集氧氣和 pH 傳感器測(cè)量值 24 小時(shí)。在數(shù)據(jù)采集過(guò)程中，沒(méi)有打開(kāi)培養(yǎng)箱以避免任何氣體和溫度波動(dòng)。

圖 2：實(shí)驗(yàn)裝置：A) 連接到光纖儀表和計(jì)算機(jī)的傳感器圖像，B) 注射泵和芯片的圖像，C) 培養(yǎng)箱內(nèi)的芯片和連接的光纜。

圖 2：實(shí)驗(yàn)裝置：A) 連接到光纖儀表和計(jì)算機(jī)的傳感器圖像，B) 注射泵和芯片的圖像，C) 培養(yǎng)箱內(nèi)的芯片和連接的光纜。

在微流控芯片中動(dòng)態(tài)培養(yǎng) 24 小時(shí)后，將含有 15 µM 二硫蘇糖醇 (DTT) 的裂解緩沖液移液到通道中以裂解細(xì)胞。收集裂解物并儲(chǔ)存在-80°C 用于 RNA 分離。使用 Macherey-Nagel RNA 分離試劑盒分離 RNA。通過(guò) qPCR 分析根據(jù)其 TNFα、IL-6 和 iNOS 基因表達(dá)水平比較對(duì)照組和 M1 組。

在 24 小時(shí)孵育期間從微流控芯片出口收集的上清液用于 ELISA。Affymetrix eBioscience 小鼠 TNFα 試劑盒已根據(jù)制造商說(shuō)明使用。為了驗(yàn)證我們的傳感器讀數(shù)并確認(rèn) M1 極化，我們確定了對(duì)照組和 M1 組釋放的 TNFα 水平。

結(jié)果

溶解氧顯示 LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞和未刺激的對(duì)照組減少。雖然在兩種情況下都有類(lèi)似的趨勢(shì)，但在 24 小時(shí)的刺激期間，M1 極化小膠質(zhì)細(xì)胞的氧水平低于對(duì)照。對(duì)于 LPS 刺激的細(xì)胞，對(duì)照的溶解氧水平降低了 22.2% 和 29.5%（圖 3A）。在 pH 監(jiān)測(cè)芯片中，pH 水平在 24 小時(shí)內(nèi)下降，其中對(duì)照的最終值為 6.8，LPS 刺激細(xì)胞的最終值為 6.5。

圖 3：24小時(shí)刺激期間O 2和 pH 曲線的傳感器數(shù)據(jù)。A) 對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 O 2 % 變化，B) 對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 pH 變化。

在 24 小時(shí)結(jié)束時(shí)對(duì) TNFα、IL-6 和 iNOS 的基因表達(dá)分析顯示了顯著的倍數(shù)變化，證實(shí)了動(dòng)態(tài)微流體培養(yǎng)下 LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞的 M1 極化。ELISA 測(cè)定表明從 LPS 刺激的細(xì)胞 (M1) 釋放的 TNFα 細(xì)胞因子顯著增加。在動(dòng)態(tài)條件下 24 小時(shí)后的 TNFα 濃度測(cè)量為未刺激的對(duì)照為 102 pg/ml，LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞為 470 pg/ml。

圖 4：對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 mRNA 表達(dá)。A) 對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 TNFα mRNA 表達(dá)，B) 對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 IL-6 mRNA 表達(dá)，C) 對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 iNOS mRNA 表達(dá)。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。P 值是從雙尾學(xué)生 t 檢驗(yàn)計(jì)算的。

圖 5：從對(duì)照和 LPS 刺激的芯片出口收集的培養(yǎng)基的 TNFα 濃度水平 (pg/ml)。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。P 值是從雙尾學(xué)生 t 檢驗(yàn)計(jì)算的。

討論

本研究的最初目的是觀察 3D 培養(yǎng)中極化過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的代謝變化。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)并制造了用于 3D 動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的芯片 A，并刺激細(xì)胞向 M1 表型發(fā)展。我們觀察到，與 2D 培養(yǎng)相比，3D 培養(yǎng)中的細(xì)胞沒(méi)有有效極化。我們得出結(jié)論，成功極化的細(xì)胞數(shù)量較少可能不足以改變整體代謝測(cè)量。為了證明新型傳感系統(tǒng)在微流體研究中的優(yōu)勢(shì)，我們專(zhuān)注于更傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)，并與文獻(xiàn)討論了結(jié)果。因此，我們決定在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行二維動(dòng)態(tài)單層培養(yǎng)。這些結(jié)果也促使我們將微流控芯片 A 改為芯片 B。經(jīng)過(guò) 24 小時(shí)的刺激，我們通過(guò) qPCR 分析確保 M1 極化的成功。典型 M1 狀態(tài)標(biāo)志物 TNFα、IL-6 和 iNOS 的 mRNA 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。接下來(lái)，我們展示了受刺激的細(xì)胞實(shí)際上完成了從 mRNA 到蛋白質(zhì)水平的翻譯過(guò)程。為此，我們通過(guò)執(zhí)行 ELISA 測(cè)定了微流控芯片出口處分泌的 TNFα 蛋白的水平。

pH 變化與文獻(xiàn)一致：在之前的幾項(xiàng)研究中，M1 極化已被證明會(huì)導(dǎo)致 pH 水平降低，因?yàn)槭艽碳さ募?xì)胞具有更高的 ECAR。在我們的研究中，與對(duì)照芯片相比，我們能夠觀察到 LPS 刺激芯片內(nèi)的 pH 值要低得多。但是當(dāng)我們查看芯片的初始 pH 值時(shí)，它們是不同的。這可能是由于微通道內(nèi)的氣泡形成。氣泡會(huì)影響芯片介質(zhì)內(nèi)的溶解氣體濃度，而溶解氣體會(huì)改變介質(zhì)的 pH 值。CO 2通過(guò)降低 pH 值來(lái)影響介質(zhì)，另一方面，如果介質(zhì)暴露于富含氧氣的氣體中，則介質(zhì)的 pH 值會(huì)增加。如果對(duì)照介質(zhì)暴露于 O 2豐富的氣泡，這可以解釋較高的 pH 值。這種差異還有另一種可能性。設(shè)置實(shí)驗(yàn)和開(kāi)始測(cè)量大約需要 40 分鐘。在測(cè)量開(kāi)始之前將細(xì)胞暴露于刺激因子。這可能是由于 LPS 刺激的細(xì)胞在刺激后通過(guò) iNOS 的形成降低了培養(yǎng)基的 pH 值[7]。

O 2水平與文獻(xiàn)不符：N9 小膠質(zhì)細(xì)胞的 LPS 刺激降低了增殖率并改變了細(xì)胞代謝，使其成為糖酵解依賴(lài)性。細(xì)胞代謝的這些變化導(dǎo)致耗氧量降低，并且由于細(xì)胞周期停滯 [9] 與相對(duì)較低的細(xì)胞數(shù)量相結(jié)合，LPS 刺激細(xì)胞的溶解氧水平測(cè)量值預(yù)計(jì)將高于對(duì)照，并且必須具有增加的趨勢(shì)24小時(shí)刺激。我們的結(jié)果顯示 LPS 刺激細(xì)胞的氧水平降低了 7%。必須進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)以更好地理解為什么會(huì)出現(xiàn)這種與文獻(xiàn)的分歧。